Esame istologico

L'esame citologico è effettuato dall'anatomopatologo, cioè un chirurgo specialista in anatomia patologica, il quale esamina il campione prelevato per verificare le caratteristiche delle cellule che lo compongono. In questo modo, è possibile stabilire il tipo istologico dei tessuti.

L'esame istologico può essere effettuato anche mentre l'operazione chirurgica è in atto, sfruttando dei metodi che permettono di avere dei risultati in tempi ridotti.

L'istologia prevede in sostanza una valutazione microscopica delle caratteristiche morfologiche di un frammento di tessuto.

Un esempio di impiego dell'esame citologico è la conizzazione, che permette di analizzare tramite esame istologico una piccola parte del collo dell'utero, asportata chirurgicamente per rimuovere le lesioni che interessano quest'area.

Inoltre, l'esame istologico può essere utilizzato in caso di polipi intestinali. Dopo la rimozione infatti, è considerato esame di routine l'analisi dei polipi per constatarne la natura. 

L'esame citologico della mammella si esegue con un semplice ago da siringa all'interno del nodulo o della zona interessata. La biopsia al seno è spesso accompagnata all'utilizzo dell'ecografia.

Tale esame non è invasivo o doloroso e non necessita di anestesia locale. La stessa tecnica è utilizzata per l'agoaspirazione dei linfonodi portati all'attenzione medica, sia nelle zone ascellari che in altre sedi, come ad esempio il collo. 

Esistono 4 tipi fondamentali di tessuti esaminati: tessuto muscolare, tessuto nervoso, tessuto connettivo e tessuto epiteliale. Tutti i tipi di tessuto sono sottotipi di questi 4 tipi di tessuto di base (per esempio, il sangue è classificato come tessuto connettivo, poiché le cellule del sangue sono sospese in una matrice extracellulare, il plasma).

Ecco un elenco dei vari tessuti analizzabili:

I fissativi chimici vengono utilizzati per preservare il tessuto dal degrado e per mantenere la struttura della cellula e dei componenti sub-cellulari come gli organi cellulari (ad esempio nucleo, reticolo endoplasmatico, mitocondri). Il fissativo più comune per la microscopia leggera è la formalina tamponata neutra al 10% (4% di formaldeide in soluzione salina fosfata tamponata).

Per la microscopia elettronica, il fissativo più comunemente usato è la glutaraldeide, di solito come soluzione di 2,5% in soluzione salina fosfata. Questi fissativi preservano i tessuti o le cellule principalmente mediante proteine ​​incrociate irreversibilmente. L'azione principale di questi fissativi di aldeide è quella di raggruppare i gruppi amminici nelle proteine ​​attraverso la formazione di ponti metilenici, nel caso di formaldeide o da collegamenti C5H10 in caso di glutaraldeide. Questo processo, pur preservando l'integrità strutturale delle cellule e dei tessuti, può danneggiare la funzionalità biologica delle proteine, in particolare degli enzimi e può anche denaturarli in una certa misura. Questo può essere dannoso per alcune tecniche istologiche. Altri fissativi vengono spesso utilizzati per la microscopia elettronica come il tetrossido di osmio o l’uranile acetato.

La fissazione di formalina porta al degrado di mRNA, miRNA e DNA, nonché la denaturazione e la modifica delle proteine ​​nei tessuti. Tuttavia, l'estrazione e l'analisi degli acidi nucleici e delle proteine ​​dai tessuti incorporati in formalina, fissi con paraffina, è possibile utilizzando adeguati protocolli.

La procedura con sezione congelata è un modo rapido per fissare e montare sezioni di istologia utilizzando un dispositivo di refrigerazione chiamato criostato. Viene spesso utilizzato dopo la rimozione chirurgica dei tumori per consentire una rapida determinazione del margine (ovvero il tumore è stato completamente rimosso).

Lo scopo del trattamento dei tessuti è quello di rimuovere l'acqua dagli stessi e sostituirli con un mezzo che solidifica per consentire il taglio di sezioni sottili. Il tessuto biologico deve essere supportato in una matrice dura per consentire il taglio di sezioni sufficientemente sottili, di spessore di 5 μm (micrometro, 1000 micrometro = 1 mm) per la microscopia leggera e di spessore di 80-100 nm (nanometro, 1.000.000 nanometri = 1 mm) per il microscopio elettronico.

Per la microscopia leggera, la cera di paraffina è più frequentemente utilizzata. Dal momento che è immiscibile con l'acqua, costituente principale del tessuto biologico, l'acqua deve prima essere rimossa nel processo di disidratazione. I campioni vengono trasferiti attraverso bagni di etanolo progressivamente più concentrato per rimuovere l'acqua. Questo è seguito da un agente di compensazione idrofobica (come lo xilene) per rimuovere l'alcool, e infine la cera paraffina fusa, l'agente di infiltrazione, che sostituisce lo xilene. La cera di paraffina non fornisce una matrice sufficientemente dura per tagliarla in sezioni molto sottili per la microscopia elettronica. Al contrario, vengono utilizzate resine. Le resine epossidiche sono le più diffuse, ma vengono utilizzate anche resine acriliche, in particolare dove è richiesta l'immunoistochimica. Le sezioni più spesse (da 0,35 μm a 5 μm) di tessuto incorporato in resina possono essere tagliate anche per la microscopia leggera. Ancora una volta, l'immiscibilità della maggior parte delle resine epossidiche e acriliche con acqua richiede l'uso di disidratazione, di solito con etanolo.

Dopo che i tessuti sono stati disidratati, eliminati e infiltrati con il materiale di incorporazione, sono pronti per l'incorporazione esterna. Durante questo processo, i campioni di tessuto vengono posizionati in stampi insieme a materiale di incollaggio liquido (come agar, gelatina o cera) che viene quindi indurito. Ciò si ottiene raffreddando nel caso di cera di paraffina e di riscaldamento nel caso delle resine epossidiche. Le resine acriliche sono polimerizzate con calore, luce ultravioletta o catalizzatori chimici. I blocchi induriti che contengono i campioni di tessuto sono quindi pronti per essere sottoposti a sezione.

Per la microscopia leggera, un coltello in acciaio montato in un microtomo viene utilizzato per tagliare le sezioni di tessuto spesso di 4 micrometri.

Per la microscopia elettronica di trasmissione, un coltello diamantato montato in un ultramicrotomo viene utilizzato per tagliare sezioni di tessuto di spessore di 50 nanometri montate su una griglia di rame da 3 millimetri di diametro. Le sezioni possono essere tagliate attraverso il tessuto in varie direzioni.

Per la valutazione patologica dei tessuti, il taglio verticale (tagliato perpendicolare alla superficie del tessuto per produrre una sezione trasversale) è il metodo abituale. La sezione di taglio orizzontale (nota anche come trasversale o longitudinale), tagliata lungo l'asse del tessuto, viene spesso utilizzata nella valutazione dei follicoli piliferi e delle unità pilosebacee.

Il tessuto fisso o non fisso può essere congelato e affettato utilizzando un microtomo montato in un dispositivo di refrigerazione noto come criostato. Le sezioni congelate sono montate su una lastra di vetro e possono essere macchiate per migliorare il contrasto tra diversi tessuti. Le sezioni congelate non confezionate possono essere utilizzate anche per studi che richiedono la localizzazione degli enzimi nei tessuti e nelle cellule. È necessario fissare il tessuto per determinate procedure come la colorazione immunofluorescenza con anticorpo. Il sezionamento congelato può anche essere utilizzato per determinare se un tumore è maligno quando si trova incidentalmente durante la chirurgia su un paziente.

Recentemente, sono stati usati anticorpi per specificare proteine, carboidrati e lipidi. Questa tecnica ha notevolmente aumentato la capacità di identificare le categorie di cellule sotto un microscopio. La microscopia a fluorescenza e la microscopia confocale vengono utilizzate per rilevare segnali fluorescenti con buoni dettagli intracellulari. Le fotocamere digitali sono sempre più utilizzate per catturare l'immagine istologica e istopatologia.